Razvoj autoimunskih stanja

Hepatitis C može biti praćen razvojem autoimunih stanja. Razvoj autoimunih stanja moguć je kod svih osoba, jer svi poseduju gene koji kodiraju repertoar imunokompetentnih ćelija u okviru koga je moguće reagovanje i sa sopstvenim antigenima (Himoto, 2008; Elkon, 2009). Tokom normalnog imunološkog odgovora na strane antigene, stvara se i mala količina autoantitela. Pojava tzv  ”prirodnih auto antitela – AAt” (obično klase IgM, u niskom titru i malog afiniteta) kod zdravih osoba, ukazuje na postojanje potencijala za nastanak autoimunosti. Ta AAt ne izazivaju lezije. Pomenuta mogućnost nastanka autoimunih bolesti većinom se ne ostvaruje, zahvaljujući kontrolnim mehanizmima među kojima su najvažniji indukcija i održavanje imunološke  tolerancije. Patološka autoimunost nastaje kada se stvara veća količina AAt sa velikim afinitetom za odgovarajuće autoantigene. To se događa kada se mehanizmi nastanka i održavanja imunološke tolerancije poremete, pa ona slabi ili izostaje. Tada nastaju autoimune reakcije, tj. pojava autoimunosti pa i razvoj pravih autoimunih oboljenja koja vode ka hroničnim inflamatornim oboljenjima koja se manifestuju u vidu šećerne bolesti, tireoiditisa, multiple skleroze i autoimunog hepatitisa (Himoto, 2008). Prema definiciji, autoimunost se karakteriše gubitkom tolerancije na sopstvene antigene, i ne predstavlja virusnu infekciju jer se dijagnoza autoimunih oboljenja postavlja kada su povišeni nivoi seroloških markera koji određuju autoimunost kao što su povišeni gamaglobulini  i autoantitela i isključena virusna etiologija. U hepatologiji se determinišu hronična zapaljenska stanja kao što su: autoimuni hepatitis, hronični virusni hepatitis, primarna bilijarna ciroza i sklerozirajući holangitis. U tim stanjima portna inflamacija je prisutna i često se ne može razlikovati ni histološki, ni povišenim nivoom aminotransferaza, ni tipičnim sekvelama karakterističnim za hronična oboljenja, što uključuje i cirozu i portnu hipertenziju.

Tačni molekularni, celularni i patofiziološki mehanizmi koji vode ka autoimunosti nisu još uvek kompletno razjašnjeni.

Slabljenje i/ili prestanak imunološke tolerancije nastaje usled abnormalne selekcije autoreaktivnih klonova, abnormalne stimulacije limfocita koji inače kod zdravih osoba tolerišu sopstvene antigene organizma, ili oslobađanjem sekvestriranih antigena (Elkon, Casali, 2009). Značajnu ulogu imaju kombinacije lokalnih i sistemskih alteracija, uz jak uticaj genetskih faktora.

Molekulska mimikrija

Unakrsne reakcije sopstvenih i stranih antigena su veoma značajne u nastanku autoimunih reakcija (Christen, 2010). Neke bolesti koje se često nazivaju autoimunim, mogu biti inicirane tokom normalnog imunog odgovora na strane, npr. mikrobske antigene zbog toga što T ćelije ili antitela na pomenute produkte mogu reagovati i sa unakrsno reaktivnim sopstvenim antigenima (molekulska mimikrija). Striktno gledajući, bolesti u čijoj su osnovi takve reakcije, predstavljaju sekvele normalnog imunog odgovora na strane antigene a ne prave autoimune bolesti. U osnovi molekulske mimikrije je sličnost strukture sopstvenih i stranih antigena (Himoto, 2008). To je najčešće uslovljeno prisustvom više kraćih segmenata molekula antigena čije sekvence su homologne kod sopstvenih i kod stranih antigena. Veoma su značajne homologije strukture molekula MHC sa nekim od stranih antigena što može biti preduslov za nastanak nekih autoimunih bolesti.

Strukturne sličnosti postoje između niza čovečijih antigena s jedne, i antigena mikroba s druge strane.

Ukrštena reaktivnost proteina HCV i humanih proteina

Imunološka unakrsna reaktivnost između C kapsidnog proteina i humanog GOR proteina dovodi do poremećaja koji se sreće kod autoimunog hroničnog hepatitisa i nekih drugih oboljenja jetre izazvanih hroničnom virusnom infekcijom tipa C. Ova imunološka unakrsna reaktivnost je posledica homologije humanog peptide GOR 19-17 i HCV kapsidnog peptide 9-17 (Michel G, 1992).

Autoimuni hepatitis tipa 2 se epidemiološki povezuje sa infekcijom hepatitisa C. Pretpostavlja se da je ovo oboljenje posledica sekundarnog autoimunog odgovora  prouzrokovanog  unakrsnom reaktivnošću izmedju homologih epitopa u okviru kapsidnog proteina  HCV i humanog citohroma C450 (Bogdanos, Dalekos, 2008). Glomerulonefritis, arthritis, tireoiditis, mogu biti pokrenuti HCV infekcijom.

Nedavno su identifikovani epitopi koji su odgovorni za pojavu autoantitela  reaktivnih sa nukleusnim antigenima – antinukleusna antitela (ANA), i proteinima ćelija glatkih mišića, SMA autoantitela. Na osnovu rezultata analiza proteinskih baza podataka i kompetetivnih in vitro eksperimenata, zaključeno je da je prisustvo ovih autoantitela najverovatnije posledica unakrsno reaktivnog imunog odgovara na HCV i antigene glatkih mišića i jedra (Himoto, 2008).

Oštećenje tkiva jetre započinje kada T-citoksični limfociti prepoznaju virusni antigen i pokrenu kaskadu transdukcionih signala protein tirozin kinaza (PTK) i protein-tirozinfosfataza (PTP). Tri citoplazmatske PTK (lek,Fyn i ZAP – 70) i transmembranska PTP – CD45, pokreću signalnu transdukciju T-limfocitnih receptora.

Etiološka dijagnoza HCV prema preporuci Internacionalne asocijacije za ispitivanje bolesti jetre, bazira se na visoko specifičnim testovima treće generacije koja uključuje epitope NS5 regiona.

Međutim, analiza humanih proteina iz proteinske baze Swissprot,  pokazala je da postoji homologija između regiona NS5 proteina i tri humana proteina azot-oksid sintaze, tirozin kinaze – Lck, prototoonkogena i aktivatora hepatocitnog faktora rasta (Vasiljević, Marković, 2005).

Protoonkogen-tirozin kinaza Lek je protein sačinjen od 508 aminokiselina koji ima escencijalnu  ulogu u razvoju T-ćelija i signalizaciji T-ćelijskog  receptora. Eksprimira se u timusu, limfnim čvorovima, krvi, jajnim i ćelijama dojke, pankreasu i jetri. Identifikovana su prirodna autoantitela reaktivna sa ovim proteinom.

Azot oksid sintaza 2 je inducibilan molekul koji se eksprimira u jetri, a regulisan putem kalmodulina. Ekspresiju i funkciju ovog enzima inhibira aspirin. Njegova funkcija je proizvodnja azot oksida koji je messenger molekul sa različitim aktivnostima u organizmu. Pored toga ovaj molekul ima važnu ulogu u kontroli autoimunog odgovora.

Aktivator hepatocitnog faktora rasta pripada porodici peptidaza. Eksprimira se samo u jetri. Prevodi hepatocitni faktor rasta iz jednolančane u heterodimernu, aktivnu formu.

Autoantitela reaktivna sa nekim od ovih peptida su mogući uzročnik nespecifičnih rezultata pri testiranju dobrovoljnih davalaca krvi trećom generacijom enzimoimunih testova. Približno 30% svih antitela prisutnih u svakom normalnom serumu predstavljaju prirodna autoantitela koja služe za održavanje homeostaze imunog sistema. Ova antitela takođe regulišu  fiziološke procese  povezane sa ćelijskim metabolizmom: transport hranljivih materija (riboflavin,spermin…) do ćelija kao i kataboličkih proizvoda internog ćelijkog metabolizma (denaturisanih i degradiranih proteina abdormalnih  self i stranih

ćelija).

Zbog navedenih razloga  pravilan izbor i kombinacija antigenskih  determinanti HCV u testu predstavlja  osnovni parameter od kojih zavisi pouzdanost testa.

Autor ;

Prim.Dr.sci.med. Nada Vasiljević, specijalista-transfuziolog

I doktor AyurVeda medicine

Tehnološki razvoj medicinske opreme uz poboljšanje skrining tehnika za detekciju markera infektivnih bolesti je značajno smanjio rizik posttransfuzijskog hepatitisa i retrovirusnih infekcija. Međutim, potencijalni rizik od prenošenja prionskih bolesti (Creutzfeld-Jacob disease, Gerstmann-Staeussler-Schinkerovo disease, kuru i fatalna familijarna insomnija) transfuzijom krvi/hemoproduktima je skrenulo pažnju ka novim serološkim tehnikama i savremenoj medicinskoj dijagnostici u transfuziološkim ustanovama koje moraju biti suočene sa potrebom da prepoznaju i spreče širenje transfuzijom prenesenih oboljenja.

Mada transfuzija krvi jeste efikasan put prenošenja infektivnog agensa, mora se imati u vidu da ona pod fiziološkim okolnostima nije i primarni način prenošenja infekcije. Sa transfuziološkog aspekta, problem transfuzijskih transmisivnih infekcija zavisi od više činilaca – prvenstveno od zastupljenosti infektivnog agensa u opštoj populaciji (a naročito u populaciji davalaca krvi) i postojanja ili odsustva imuniteta primalaca prema toj infekciji. Zbog toga, pored obezbeđenja specifičnih i kvalitetnih hemoprodukata, iznalaženje i sprovođenje mera za sprečavanje infekcija predstavlja jedan od najznačajnijih zadataka transfuziologije.

Zajedničke karakteristike infektivnih agenasa koji mogu biti prenete transfuzijom su sledeće: a) relativno dugo prisustvo u cirkulaciji (uz postojanje stanja hroničnog kliconoštva ili latentnosti infekcije); b) da oboljenjima koja izazivaju prethodi relativno dug inkubacioni period; c) da mogu da uzrokuju asimptomatsku infekciju i d) stabilnost u uskladištenim hemoproduktima. Sve to govori da bi idealno bilo kada bi se jedinice krvi testirale na prisustvo markera svih onih infekcija koje su zastupljene u određenoj populaciji i koje, ako su prenete transfuzijom, mogu uzrokovati tešku bolest u primaocu. Danas su na raspolaganju brojni pogodni i veoma osetljivi testovi za skriningovanje davalaca krvi na prisustvo markera većine infektivnih agenasa koji mogu da uzrokuju značajan morbiditet u primalaca. Nažalost, njihovom primenom se ne mogu otkriti svi davaoci koji su infektivni u momentu davanja krvi.

Prenošenje virusa hepatitisa tipa B (HBV), tipa C (HCV), tipa D (HDV) citomegalovirusa (CMV) i virusa humane imunodeficijencije (HIV) transfuzijom predstavlja danas glavni rizik hemoterapije, kada su u pitanju infektivne komplikacije.

Danas se u transfuzijske-transmisivne bolesti ubrajaju:

VIRUSNE

• virusi hepatitisa tipa A,B,C,D,E,F, i G;
• virusi humane imunodeficijencije“ HIV-, HIV-2;
• virusi humane T-cell leukemije/limfomi“ HTLV-1, HTLV-2;
• Cytomegalovirus;
• Epstein-Barr-ov virus;
• parvoB-19;
• herpes virusi

PARAZITARNE

• sifilis;
• malarija;
• Chagasova bolest;
• Babesioze;
• Leishmania tropica;
• Toxoplasma gondii;

Redosled uvodjenja testova radi detekcije infektivnog agensa u cirkulaciji je prikazan u tabeli

Tabela 1. Redosled uvođenja testova u transfuziološku praksu⁽²⁾

Primenom najsavremenijih  testova, a radi sprečavanja širenja ovih bolesti ostao je i dalje određen rizik od prenošenja agensa skriningovanim jedinicama krvi i on iznosi:

Tabela 24.2. Rizik od transmisije uzročnika infektivnih bolesti po transfundovanoj jedinici (26)

Otkrivanje osoba inficiranih virusima, bakterijama kao i drugim transfuzijskim transmisivnim agensima i dalje predstavlja osnovni kriterijum kojim se danas može suprostaviti širenju ovih bolesti – tim pre što ne stoji na raspologanju dovoljno efikasna antivirusna terapija. S tim u vezi razvijaju se i dalje brojni testovi visoke osetljivosti i specifičnosti.

Uvođenje svakog novog testa zahteva analizu sigurnosti i ekonomičnosti testiranja, uzimajući u obzir i korist od izvođenja datog preliminarnog (skriningujućeg) i/ili potvrdnog testa. Testovi za skriningovanje davalaca krvi, pored specifičnosti i visoke osetljivosti, trebalo bi da budu jednostavno izvodljivi i maksimalno automatizovani, kako bi se sprečila greška zbog subjektivnosti (faktor čovek) u očitavanju rezultata.

Markeri infekcije

Markeri infekcije su detektabilni znaci infekcije koji se pojavljaju u krvi za vreme ili posle infekcije. Mogu biti prisutni i sami, mada znatno češće je prisustvo specifičnih antitela protiv infektivnog agensa na koji se vrši testiranje. Rezultati testiranja se mogu klasifikovati kao:

• negativan/pozitivan- određen statusom davaoca;
• nereaktivan/reaktivan određen statusom davanja;

• neodređen.

U praksi testiranje dobrovoljnih davalaca krvi ostavlja veliki broj nerešenih problema vezanih kako za izbor adekvatnog preliminarnog testa tako i za interpretaciju dobijenih rezultata. Stepen pouzdanosti i korektna interpretacija rezultata testa otvoraju probleme koji se u praksi najčešće manifestuju u vidu lažno reaktivnih ili lažno negativnih rezultata testa.

Uzroci lažno reaktivnih i lažno negativnih rezultata pri detekciji antitela na pristvo virusa humane imunodeficijencije (HIV) i virusa hepatitisa tipa C (HCV) su: krosreaktivnost između antitela dobijenih na antigene virusnih infekcija i antitela  indukovanih humanim antigenima ili drugim virusima, prisustvo ćelijskih antigena u lizatima, „pseudo epitopi“ koji se javljaju kao posledica konformacione razlike između virusnih antigena i antigena dobijenih rekombinantnim odnosno sintetskim putem. Dodatnu poteškoću u interpretaciji rezultata predstavlja odsustvo direktne korelacije između jačine signala u inicijalnom skrining testu i rezultata potvrdnog Western blot testa kao i rezultata dobijenih tehnikom PCR.

Na bazi rezultata preliminarnog i potvrdnog testa sve testirane osobe se svrstavaju u sledeće 4 grupe:

• stvarno pozitivne;
• lažno pozitivne;
• lažno negativne;

• stvarno negativne.

Na osnovu međusobnog odnosa ovih grupa definišu se osetljivost i specifičnost, dva osnovna parametra koji karakterišu pouzdanost dijagnostičkog testa.

Osetljivost preliminarnog testa definisana je frekvencom pozitivnih  ELISA (enzyme linked immunoapsorbent assay) rezultata dobijenih testiranjem populacije stvarno pozitivnih individua (0=A/(A+ C)%). Specifičnost je svojstvo testa da neinficirane osobe označi kao nereaktivne (S= D (D +B)% ). Vrednosti osetljivosti i specifičnosti deklarisane od strane proizvođača testova kreću se od 98,3% do 100% i od 99,2% do 100%..

Mada ove vrednosti na prvi pogled izgledaju veoma impresivno u praksi je sasvim drugačija situacija.

One zavise u značajnoj meri od učestalosti infektivnog agensa u populaciji koja se testira. To znači da pozitivna prediktivna vrednost testa raste (smanjuje se broj lažno reaktivnih rezultata) pri testiranju visoko rizičnih populacija. U slučaju testiranja niskorizičnih populacija negativna prediktivna vrednost testa se smanjuje (raste broj lažno reaktivnih rezultata). U preliminarnom testiranju nisko rizične grupe dobrovoljnih davalaca krvi osetljivost testa je znatno važnija od specifičnosti pošto smanjuje mogućnost da jedinica krvi lažno nereaktivnih osoba bude upotrebljena. Bez obzira na ovo potrebno je voditi računa i o specifičnosti da bi se smanjio broj lažno reaktivnih rezultata, ne samo iz ekonomskih razloga da bi se smanjilo nepotrebno korišćenje skupih potvrdnih testova, već prvenstveno zbog toga da bi se izbeglo izlaganje dobrovoljnih davalaca krvi nepotrebnom stresu.

Tako se procenjuje na osnovu rezultata sistematskih studija da 68% do 89% reaktivnih rezultata pri testiranju ove niskorizične grupe predstavljaju lažno reaktivne rezultate. Na osnovu izloženog se može  zaključiti da izbor adekvatnog ELISA testa za preliminarno testiranje dobrovoljnih davalaca krvi nije jednostavan zadatak. Da bi se on korektno obavio neophodno je pri izboru koristiti kriterijume koji proizilaze iz komparativne analize faktora koji utiču na osetljivost i specifičnost.

Poslednjih godina ponovo se puno pažnje posvećuje izučavanju rizika prenošenja bakterijskih infekcija transfuzijama. Danas je poznato da se posttransfuzijske septičke reakcije češće javljaju posle transfuzije preparata trombocita, nego transfuzije eritrocita. To je, najverovatnije, zato što se preparati trombocita skladište na ambijentalnoj temperaturi od 20+2^o C (i to do pet dana), čime su stvoreni bolji uslovi za razmnožavanje bakterija, nego u preparatima eritrocita koji su skladišteni na temperaturi od 4+2^o C.

Prema objavljenim podacima, fatalne posttransfuzijske komplikacije izazvane sepsom se javljaju sa učestalošću od oko 1:6.000.000 transfundovanih jedinica. Međutim, nije moguće proceniti učestalost teškog morbiditeta, izazvanog transfuzijom hemoprodukata zagađenih bakterijama. Laboratorijski podaci ukazuju na to da bakterije mogu biti dokazane kultivacijom u oko 0,3% preparata koncentrovanih trombocita, ali značaj tih nalaza nije jasno definisan. Naime, nije poznato da li ti, in vitro podaci, predstavljaju stvarnu kontaminaciju jedinica, niti se zna da li su male količine transfundovanih bakterija stvarni uzrok infektivnog sindroma u primaoca.

Danas je opšteprihvaćeno da uspešna prevencija transfuzijskih transmisivnih infekcija zahteva:

• Što bolje poznavanje biologije infektivnih agenasa koji uzrokuju TTI, kao i njihove vijabilnosti u krvi/hemoproduktima;
• Prepoznavanje infekcija i redovno izveštavanje o njima;
• Otkrivanje i isključenje davalaca sa velikim rizikom infekcije (anamnezom, kliničkim pregledom i serološkim testiranjem jedinica krvi);
• Identifikaciju imunosuprimiranih bolesnika koji su posebno prijemčivi za infekciju;
• Što tačnije procenjivanje relativnog rizika aplikacije pojedinih hemoprodukata;
• Razvijanje što efikasnijih postupaka za inaktivaciju infektivnih agenasa u krvi/hemoproduktima.

Za značajno smanjivanje rizika od infekcija neophodna je istovremena primena više mera i procedura – one najčešće obuhvataju: a) isključivanje (ili bar minimizaciju) neopravdanih transfuzija krvi/hemoprodukata; b) svođenje na najmanju meru izlaganje primalaca multiplim davaocima; c) otkrivanje i isključivanje davalaca rizičnih grupa (detaljna anamneza); d) obavezno skriningovanje jedinica krvi specifičnim i što osetljivijim testovima i e) modifikaciju jedinica krvi posle kolekcije na primer, redukcija broja krvnih ćelija u kojima se infektivni agens obično nalazi, inaktivacija virusa i drugo.

Autor ;

Prim.Dr.sci.med.Nada Vasiljević,specijalista-transfuziolog

I doktor AyurVeda medicine

Prion je proteinska infektivna čestica (Proteinaceous Infectious Particle) koja izaziva:

• kuru – naziv po afričkom plemenu gde je registrovana bolest;
• Jakob-Creutzfeldtovu bolest (CJD);
• Gerstmann-Straussler-Scheiner bolest i
• fatalnu familijarnu insomniju

Ima neke elemente virusa – filtracija, kao i elemente koji nemaju karakter virusa – rezistentni na temperaturi od 100^oC i na jonizujuće i ultravioletne zrake. Nalazi se u svim višim kičmenjacima, za sada sa nepoznatom funkcijom. Normalna ćelijska varijanta nije infektivna, a postoje i infektivne forme za koje se smatra da su odgovorne za bovin spongiformni encefalitis (Bovine Serum Encephalitis – BSE). Uočeno je da se prenosi sa jedne životinjske vrste na drugu i da postoji samo razlika u konformaciji (sekundarnoj i tercijernoj) između prirodne i infektivne forme 79-88. Isto tako, prion je komponenta scrapi agensa.

Većina obolelih od  Jakob-Creutzfeldtove bolesti se klasifikuju  kao sporadični slučajevi pošto se smatra da se prion spontano, sa izmenjenom formom replicira i akumulira u mozgu. Oko 10-15% osoba obolelih od  Jakob-Creutzfeldtove ima bolest u okviru porodice uzrokovane sa jednim ili više od 20 poznatih mutacija, a veoma mali broj (250) jatrogenih slučajeva se javlja kod osoba koje su primale kontaminirane pituitarne hormone rasta, ili kontaminirane izmenjenom prionskom česticom neurohirurškim instrumentima pri transplataciji cornee ili dure mater.

Laboratorijska dijagnostika prionskih oboljenja za sada nije moguća. Inkubacioni period je dugačak (do 25 godina). Između 1979. i 1990. godine, objavljeno je 2614 slučajeva CJD u SAD, a broj značajno raste kod ljudi starijih od 50 godina (26). FDA je od 1987. godine dao preporuke:

1. a) da se od davanja krvi odbiju svi dobrovoljni davaoci koji su ranije tretirani sa hGH (hormon rasta životinjskog porekla) jer postoji mogućnost da osobe koje su ga primale mogu transfuzijom preneti infektivni agens primaocima i
2. b) da se od davanja odbiju i svi davaoci koji u porodici imaju osobe koje su bolovale od CJD ili im je izvršena transplatacija dure mater (26).

Mada postoje brojni literaturni podaci koji ukazuju na mogućnost prenošenja prionske bolesti putem transfuzije krvi, za sada ne postoji statistička potvrda ovog fenomena. Uprkos ovoj činjenici mnoge zemlje u preventivne mere za sprečavanje ove epidemije uvrstile su i rigoroznu kontrolu dobrovoljnih davalaca krvi. Tako je u SAD uvedena zabrana uzimanja krvi od osoba koje su posle 1980. godine provele više od 6 meseci u Engleskoj ili od osoba koje su u istom periodu provele više od 10 godina u nekoj od ostalih zapadnoevropskih zemalja. Koliko je ova mera drastična ilustruje podatak da su njome za četvrtinu smanjene ukupne rezerve krvi u Njujorku a na nivou cele SAD ovim ograničenjem ukupan godišnji broj raspoloživih transfuzija smanjen je za 300.000 do 500.000. Navedeni podaci ukazuju na svu ozbiljnost kojom su razvijene zemlje pristupile tretiranju problema mogućeg prenošenja prionske bolesti putem transfuzije krvi.

Autor

Prim.Dr.sci.med.Nada Vasiljević,specijalista-transfuziolog

I doktor AyurVeda medicine

Dijagnostički testovi za virus hepatitisa C  (HCV) mogu se klasifikovati u dve kategorije:

• serološki testovi, koji detektuju anti-HCV antitela i
• molekulski testovi, koji detektuju, kvantifikuju i/ili kvalitativno ispituju HCV RNK genom kod inficiranih osoba.

U slučaju molekulskih testova, uslovi uzimanja i skladištenja uzoraka su od velikog značaja za uspešnost testiranja, dok je osetljivost seroloških testova mnogo manja. Ipak, serološko testiranje starih uzoraka ili onih čuvanih na visokim temperaturama može rezultirati lažno pozitivnim rezultatima.

Serološki testovi se mogu podeliti u dve podgrupe:

• testovi za skrining anti-HCV antitela i
• potvrdni testovi  za potvrđivanje prisustva anti-HCV antitela.

Molekulski testovi se, dalje, mogu podeliti na kvalitativne, koji detektuju prisustvo molekula HCV RNK, kvantitativne, koji ispituju nivo virusne RNK u uzorku, i testovi za genotipizaciju virusa hepatitisa C.

Treba napomenuti da su komercijalni testovi bazirani na proteinima i peptidima poreklom isključivo od genotipa 1 HCV, što ukazuje na mogućnost smanjene efikasnosti u detekciji antitela na druge genotipove HCV.

Testovi za dokazivanje prisustva  anti-HCV antitela

Zbog niske koncentracije HCV čestica u serumu inficirane osobe, infekcija HCV-om se najčešće detektuje indirektnim putem korišćenjem enzimskih imuno-testova, tzv. EIT (engl. Enzyme ImmunoAssay) koji dokazuju prisustvo antitela domaćina sintetisanih na virusne proteine.

Prvi komercijalni EIT (1990.) bio je ELISA test (engl. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) prve generacije kojim su serumi pacijenata bili testirani na prisustvo IgG antitela za samo jedan rekombinantni virusni antigen, c100-3 antigen, koji je poreklom iz nestrukturnog NS4 proteinskog virusnog regiona (Kuo, 1989.). Uvođenje ovog testa bilo je od izuzetnog značaja za dijagnostiku infekcije HCV i smanjenja transmisije virusa putem transfuzije krvi. Ipak, prva generacija EIT nije imala odgovarajuću osetljivost i specifičnost. Stopa lažno pozitivnih rezultata procenjena je na 5-25% (Van der Poel, 1990; Contreras, 1989; Janot, 1989), dok je osetljivost testa od 60-80% (Van der Poel, 1994; Van der Poel, 1989). Zbog toga je 1992. godine prva generacija zamenjena drugom generacijom EIT. Druga generacija EIT je za razliku od prve generacije bila višeantigenski test, kod kojih nestrukturni epitop odgovara NS4 i delu NS3 regiona, tzv. c200 antigen uz koji je dodat i strukturni epitop virusnog kapsida, tzv. c22-3 antigen. Uvođenje nove generacije testova doprinelo je smanjenju broja  transmisija infekcije HCV putem transfuzije krvi (Aach, 1991; Bresters, 1992; Kolho, 1992; Van der Poel, 1992; Kleinman, 1992), tako da  u cilju daljeg poboljšanja detekcije anti-HCV antitela, razvijena je i treća generacija ELISA testova koja je u Evropi uvedena 1993. god, a u SAD 1996. ELISA testovi treće generacije, pored antigena kapsida, antigena NS3 i NS4 regiona, sadrže i antigen NS5 nestrukturnog proteinskog virusnog regiona.

Enzimoimuni testovi treće generacije su pokazali povećanje osetljivosti kod davalaca krvi, imunokompromitovanih osoba i obolelih od oboljenja jetre, ali ne i dovoljno povećanje specifičnosti (Uyttendaele, 1994; Courouce, 1994; Vernelen, 1994; Lee, 1995, Vermeersch 2010). U slučaju populacija pod visokim rizikom od infekcije, ELISA testovi druge i treće generacije pokazuju sličan stepen osetljivosti (Vrielink, 1995), dok je u populacijama pod niskim rizikom od infekcije osetljivost testova treće generacije u odnosu na testove druge generacije znatno veća (Vernelen, 1994; Goffin, 1994; Dow, 1994). Smatra se da je uočeno povećanje osetljivosti najvećim delom posledica uvođenja c-33 antigena u test, kao i da je povećanje specifičnosti reakcije na c-22 i c-100 antigene rezultat zamene dugog rekombinantnog peptida c100-3 sa kraćim sintetskim peptidima (Uyttendaele, 1994; Courouce, 1994; Barrera, 1995; Goffin, 1994). Takođe, prisustvo NS5 antigena smatra se osnovnim uzrokom lažno pozitivnih rezultata u populacijama sa niskom prevalencijom, kao što su npr. davaoci krvi. (Barrera, 1995; Dow, 1996; Vernelen, 1994). ELISA testovi treće generacije uključuju skoro ceo NS5 protein, 942 aminokiseline (ak), dok, međutim različite analize ovih testova pokazale su da NS5 antigen nije imunoreaktivan koliko i drugi antigeni, kao i da pokazuje nižu specifičnost od bilo kog drugog antigena sadržanog u testu. Uočeno je da su davaoci krvi koji nisu bili izloženi riziku od infekcije, a bili su pozitivni samo na anti-NS5 antitela, ujedno bili i PCR negativni, odnosno, uočeno je da izolovana NS5 reaktivnost obično nije asocirana sa HCV infekcijom (Boyle, 1993), iako promene u nivou HCV RNK u krvi ostavljaju tu mogućnost otvorenom. Tako, i nakon treće generacije ELISA testova lažno pozitivni rezultati ostaju problem u populacijama sa niskom prevalencijom infekcije HCV. U populacijama sa anti-HCV prevalencijom manjom od 10%, učestalost lažno pozitivnih rezultata u proseku iznosi 35%, dok u grupama imunokompromitovanih osoba učestalost lažno pozitivnih rezultata u proseku iznosi 15% (CDC, 2003).

Iako je kroz tri generacije testova njihova osetljivost povećana, testiranja unutar populacije sa visokom prevalencijom infekcije HCV, pokazala su da se ovim testovima ne detektuju svi pacijenti sa aktivnom infekcijom HCV.

U populaciji imunokompetentnih osoba, sa visokom prevalencijom, osetljivost se kreće od 98.8-100%. U populacijama imunokompromitovanih osoba i pacijenata na hemodijalizi, osetljivost se kreće od 50-95%. U slučajevima rane akutne infekcije HCV, antitela mogu biti detektovana kod 50-70% pacijenata. U preostalih 30-50% slučajeva, anti-HCV antitela se pojavljuju 3-6 nedelja kasnije. Tzv. “prozor” period iznosi u proseku 7-8 nedelja za treću generaciju EIT testova i procenjeno je da rizik od transmisije HCV putem prikupljenih jedinica krvi, usled “prozor” perioda, iznosi 1/100 000 davaoca u SAD (Schreiber, 1996) i Francuskoj (Courouce, 1996).

Osetljivost testa je, takođe, ograničena limitiranim kapacitetom čvrste faze da veže peptide ili proteine, što utiče na dostupnost epitopa, a samim tim i na osetljivost testa. Teorijski, povećanjem broja kopija glavnih epitopa sadržanih u rekombinantnom antigenu i smanjenjem broja ne-esencijalnih amino kiselina, povećava se broj dostupnih epitopa.

Upotreba skraćenih antigena koji sadrže manji broj antigenskih epitopa od kojih neki pokazuju imunološku unakrsnu reaktivnost sa humanim proteinima koji nisu u vezi sa infekcijom HCV, mogla bi da dovede do povećanja specifičnosti EI testova. Naime, pokazano je (Rodrigez – Lopez, 1999) da 30% od 543 sintetska peptida poreklom iz različitih regiona HCV-a različitih genotipova, reaguju sa proteinima iz seruma zdravih davalaca krvi, što ukazuje na potencijalnu nespecifičnu imunoreaktivnost antigenskih epitopa HCV.

Potvrdni testovi za potvrđivanje prisustva anti-HCV antitela

Potvrdni testovi su razvijeni sa ciljem da reše problem lažno pozitivnih rezultata testova za skrining anti –HCV antitela. U tu svrhu najčešće se koriste RIBA (engl. Recombinant Immunoblot Assay), testovi koji sadrže iste antigene kao EI testovi, samo u imunoblot formatu. Serum pacijenta se inkubira sa nitroceluloznom trakom obloženom HCV antigenima i jednim brojem pozitivnih i negativnih kontrola.

Prvu generaciju RIBA testova odlikovala je niska osetljivost i česta pojava neodređenih rezultata, zbog čega je prva generacija zamenjena drugom generacijom testova sa četiri virusna antigena. Uvođenje novih antigena smanjilo je učestalost neodređenih rezultata. Neodređeni rezultati pozitivni za 5-1-1 ili c100-3 antigen, najčešće su HCV RNK negativni. Izolovana, pozitivna c33c traka, u nekim slučajevima ukazuje na stvarnu infekciju, dok izolovana c22-3 traka najčešće znači i pozitivan HCV RNK test (Kiely, 2002).

Uvođenje treće generacije RIBA testova dodadatno je povećalo preciznost testiranja (Pawlotsky, 1996).

Kvalitativni molekulski testovi

Detekcija virusne RNK u serumu omogućava dijagnostikovanje infekcije HCV još u ranom akutnom stanju, pre mogućnosti detektovanja specifičnih antitela, odnosno infekcije HCV kod imunokompromitovanih osoba koje ne razvijaju anti-HCV antitela. Takođe, utvrđivanje prisustva HCV RNK u serumu pacijenta rešava pitanja lažno pozitivnih rezultata EI testova ili intermedijernih rezultata RIBA testova. Testiranje prisustva HCV RNK pokazalo se korisno i za ustanovljavanje perinatalne transmisije virusa sa majke na novorođenče.

Zbog vrlo niskog titra virusnih čestica u serumu pacijenta, virusna RNK ne može biti detektovana direktno u serumu, već se prvo mora umnožiti PCR tehnikom.

Kvantitativni molekulski testovi

Ovi testovi se uglavnom koriste za praćenje rezultata terapije, s obzirom da su mnoge studije pokazale da uspešna terapija smanjuje nivo virusne RNK kod obolelih, odnosno da je nivo virusne RNK relativno stabilan kod osoba obolelih od hroničnog hepatitisa C koje nisu lečene.

Testiranje HCV u kliničkoj praksi

Za inicijalnu identifikaciju osoba inficiranih virusom hepatitis C koriste se testovi za skrining anti-HCV antitela u serumu. U slučaju EI testova druge i treće generacije, serumi pozitivni prilikom prvog testiranja se ponovo testiraju u duplikatu. Pozitivan uzorak, u nekim slučajevima, potrebno je dopunski testirati, serološkim ili molekulskim, potvrdnim testom. Kod osoba sa povećanim nivoom serumskih transaminaza i pripadnika rizičnih grupa, pozitivan rezultat EI testa je dovoljan za postavljanje dijagnoze. Međutim, kod populacija niskog rizika, dopunsko testiranje je neophodno. U tu svrhu se može koristiti EI test drugog proizvođača, ali najčešće se koriste RIBA testovi. Prisustvo antitela na HCV u serumu ne ukazuje na to da li se radi o aktuelnoj ili prošloj virusnoj infekciji, zato je potrebno utvrditi prisustvo HCV RNK molekula u serumu. Utvrđivanje prisustva HCV RNK u serumu pacijenta primenjuje se i u slučajevima:

1. Anti-HCV slabo pozitivnih rezultata
2. Anti-HCV pozitivnih pacijenata sa normalnim nivoom enzima jetre
3. Anti-HCV negativnih pacijenata sa oboljenjem jetre koje podseća na virusni hepatitis
4. Pacijenata sa akutnim hepatitisom C
5. Monitoringa antivirusne terapije
6. Predviđanja mogućnosti transmisije HCV infekcije sa majke na dete
7. Utvrđivanja puteva transmisije

U slučaju pozitivnog testa za skrining anti-HCV antitela, negativan rezultat prilikom konfirmacionog testiranja RIBA testovima interpretira se kao odsustvo virusne infekcije, odnosno testirana osoba ne poseduje antitela na HCV, što ukazuje na lažnu pozitivnost testa za skrining anti-HCV antitela. Međutim, tokom prvih nedelja infekcije mogu se javiti lažno negativni rezultati jer se antitela još uvek ne mogu detektovati. Naime, HCV RNK se može detektovati najranije 7 – 15 dana nakon izlaganja virusu. Retki su slučajevi kada je serokonverzija odložena nekoliko meseci u odnosu na trenutak infekcije. Takođe, po završetku infekcije HCV antitela padaju ispod granice detektabilnosti, dok je u slučaju osoba sa hroničnom HCV infekcijom i imunokompromitovanih osoba, prisustvo HCV RNK jedini dokaz virusne infekcije. Neodređeni rezultati RIBA testova najčešće se sreću kod inficiranih osoba u procesu serokonverzije i nekih osoba sa hroničnom HCV infekcijom. Da bi se postavila dijagnoza potrebno je ponoviti test za skrining anti-HCV antitela nakon mesec dana ili pristupiti utvrđivanju prisustva HCV RNK u serumu.

Autor :

Prim.Dr.sci.med.Nada Vasiljević,specijalista-transfuziolog

I doktor AyurVeda medicine