Hepatologija

Testovi za otkrivanje hepatitis C virusa u serumu

Testovi hepatitis

Dijagnostički testovi za virus hepatitisa C  (HCV) mogu se klasifikovati u dve kategorije:

  • serološki testovi, koji detektuju anti-HCV antitela i
  • molekulski testovi, koji detektuju, kvantifikuju i/ili kvalitativno ispituju HCV RNK genom kod inficiranih osoba.

U slučaju molekulskih testova, uslovi uzimanja i skladištenja uzoraka su od velikog značaja za uspešnost testiranja, dok je osetljivost seroloških testova mnogo manja. Ipak, serološko testiranje starih uzoraka ili onih čuvanih na visokim temperaturama može rezultirati lažno pozitivnim rezultatima.

 

Serološki testovi se mogu podeliti u dve podgrupe:

  • testovi za skrining anti-HCV antitela i
  • potvrdni testovi  za potvrđivanje prisustva anti-HCV antitela.

 

Molekulski testovi se, dalje, mogu podeliti na kvalitativne, koji detektuju prisustvo molekula HCV RNK, kvantitativne, koji ispituju nivo virusne RNK u uzorku, i testovi za genotipizaciju virusa hepatitisa C.

 

Treba napomenuti da su komercijalni testovi bazirani na proteinima i peptidima poreklom isključivo od genotipa 1 HCV, što ukazuje na mogućnost smanjene efikasnosti u detekciji antitela na druge genotipove HCV.

 

Testovi za dokazivanje prisustva  anti-HCV antitela

 

Zbog niske koncentracije HCV čestica u serumu inficirane osobe, infekcija HCV-om se najčešće detektuje indirektnim putem korišćenjem enzimskih imuno-testova, tzv. EIT (engl. Enzyme ImmunoAssay) koji dokazuju prisustvo antitela domaćina sintetisanih na virusne proteine.

 

Prvi komercijalni EIT (1990.) bio je ELISA test (engl. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) prve generacije kojim su serumi pacijenata bili testirani na prisustvo IgG antitela za samo jedan rekombinantni virusni antigen, c100-3 antigen, koji je poreklom iz nestrukturnog NS4 proteinskog virusnog regiona (Kuo, 1989.). Uvođenje ovog testa bilo je od izuzetnog značaja za dijagnostiku infekcije HCV i smanjenja transmisije virusa putem transfuzije krvi. Ipak, prva generacija EIT nije imala odgovarajuću osetljivost i specifičnost. Stopa lažno pozitivnih rezultata procenjena je na 5-25% (Van der Poel, 1990; Contreras, 1989; Janot, 1989), dok je osetljivost testa od 60-80% (Van der Poel, 1994; Van der Poel, 1989). Zbog toga je 1992. godine prva generacija zamenjena drugom generacijom EIT. Druga generacija EIT je za razliku od prve generacije bila višeantigenski test, kod kojih nestrukturni epitop odgovara NS4 i delu NS3 regiona, tzv. c200 antigen uz koji je dodat i strukturni epitop virusnog kapsida, tzv. c22-3 antigen. Uvođenje nove generacije testova doprinelo je smanjenju broja  transmisija infekcije HCV putem transfuzije krvi (Aach, 1991; Bresters, 1992; Kolho, 1992; Van der Poel, 1992; Kleinman, 1992), tako da  u cilju daljeg poboljšanja detekcije anti-HCV antitela, razvijena je i treća generacija ELISA testova koja je u Evropi uvedena 1993. god, a u SAD 1996. ELISA testovi treće generacije, pored antigena kapsida, antigena NS3 i NS4 regiona, sadrže i antigen NS5 nestrukturnog proteinskog virusnog regiona.

Enzimoimuni testovi treće generacije su pokazali povećanje osetljivosti kod davalaca krvi, imunokompromitovanih osoba i obolelih od oboljenja jetre, ali ne i dovoljno povećanje specifičnosti (Uyttendaele, 1994; Courouce, 1994; Vernelen, 1994; Lee, 1995, Vermeersch 2010). U slučaju populacija pod visokim rizikom od infekcije, ELISA testovi druge i treće generacije pokazuju sličan stepen osetljivosti (Vrielink, 1995), dok je u populacijama pod niskim rizikom od infekcije osetljivost testova treće generacije u odnosu na testove druge generacije znatno veća (Vernelen, 1994; Goffin, 1994; Dow, 1994). Smatra se da je uočeno povećanje osetljivosti najvećim delom posledica uvođenja c-33 antigena u test, kao i da je povećanje specifičnosti reakcije na c-22 i c-100 antigene rezultat zamene dugog rekombinantnog peptida c100-3 sa kraćim sintetskim peptidima (Uyttendaele, 1994; Courouce, 1994; Barrera, 1995; Goffin, 1994). Takođe, prisustvo NS5 antigena smatra se osnovnim uzrokom lažno pozitivnih rezultata u populacijama sa niskom prevalencijom, kao što su npr. davaoci krvi. (Barrera, 1995; Dow, 1996; Vernelen, 1994). ELISA testovi treće generacije uključuju skoro ceo NS5 protein, 942 aminokiseline (ak), dok, međutim različite analize ovih testova pokazale su da NS5 antigen nije imunoreaktivan koliko i drugi antigeni, kao i da pokazuje nižu specifičnost od bilo kog drugog antigena sadržanog u testu. Uočeno je da su davaoci krvi koji nisu bili izloženi riziku od infekcije, a bili su pozitivni samo na anti-NS5 antitela, ujedno bili i PCR negativni, odnosno, uočeno je da izolovana NS5 reaktivnost obično nije asocirana sa HCV infekcijom (Boyle, 1993), iako promene u nivou HCV RNK u krvi ostavljaju tu mogućnost otvorenom. Tako, i nakon treće generacije ELISA testova lažno pozitivni rezultati ostaju problem u populacijama sa niskom prevalencijom infekcije HCV. U populacijama sa anti-HCV prevalencijom manjom od 10%, učestalost lažno pozitivnih rezultata u proseku iznosi 35%, dok u grupama imunokompromitovanih osoba učestalost lažno pozitivnih rezultata u proseku iznosi 15% (CDC, 2003).

 

Iako je kroz tri generacije testova njihova osetljivost povećana, testiranja unutar populacije sa visokom prevalencijom infekcije HCV, pokazala su da se ovim testovima ne detektuju svi pacijenti sa aktivnom infekcijom HCV.

 

U populaciji imunokompetentnih osoba, sa visokom prevalencijom, osetljivost se kreće od 98.8-100%. U populacijama imunokompromitovanih osoba i pacijenata na hemodijalizi, osetljivost se kreće od 50-95%. U slučajevima rane akutne infekcije HCV, antitela mogu biti detektovana kod 50-70% pacijenata. U preostalih 30-50% slučajeva, anti-HCV antitela se pojavljuju 3-6 nedelja kasnije. Tzv. “prozor” period iznosi u proseku 7-8 nedelja za treću generaciju EIT testova i procenjeno je da rizik od transmisije HCV putem prikupljenih jedinica krvi, usled “prozor” perioda, iznosi 1/100 000 davaoca u SAD (Schreiber, 1996) i Francuskoj (Courouce, 1996).

 

Osetljivost testa je, takođe, ograničena limitiranim kapacitetom čvrste faze da veže peptide ili proteine, što utiče na dostupnost epitopa, a samim tim i na osetljivost testa. Teorijski, povećanjem broja kopija glavnih epitopa sadržanih u rekombinantnom antigenu i smanjenjem broja ne-esencijalnih amino kiselina, povećava se broj dostupnih epitopa.

Upotreba skraćenih antigena koji sadrže manji broj antigenskih epitopa od kojih neki pokazuju imunološku unakrsnu reaktivnost sa humanim proteinima koji nisu u vezi sa infekcijom HCV, mogla bi da dovede do povećanja specifičnosti EI testova. Naime, pokazano je (Rodrigez – Lopez, 1999) da 30% od 543 sintetska peptida poreklom iz različitih regiona HCV-a različitih genotipova, reaguju sa proteinima iz seruma zdravih davalaca krvi, što ukazuje na potencijalnu nespecifičnu imunoreaktivnost antigenskih epitopa HCV.

 

Potvrdni testovi za potvrđivanje prisustva anti-HCV antitela

Potvrdni testovi su razvijeni sa ciljem da reše problem lažno pozitivnih rezultata testova za skrining anti –HCV antitela. U tu svrhu najčešće se koriste RIBA (engl. Recombinant Immunoblot Assay), testovi koji sadrže iste antigene kao EI testovi, samo u imunoblot formatu. Serum pacijenta se inkubira sa nitroceluloznom trakom obloženom HCV antigenima i jednim brojem pozitivnih i negativnih kontrola.

Prvu generaciju RIBA testova odlikovala je niska osetljivost i česta pojava neodređenih rezultata, zbog čega je prva generacija zamenjena drugom generacijom testova sa četiri virusna antigena. Uvođenje novih antigena smanjilo je učestalost neodređenih rezultata. Neodređeni rezultati pozitivni za 5-1-1 ili c100-3 antigen, najčešće su HCV RNK negativni. Izolovana, pozitivna c33c traka, u nekim slučajevima ukazuje na stvarnu infekciju, dok izolovana c22-3 traka najčešće znači i pozitivan HCV RNK test (Kiely, 2002).

Uvođenje treće generacije RIBA testova dodadatno je povećalo preciznost testiranja (Pawlotsky, 1996).

 

 

Kvalitativni molekulski testovi

Detekcija virusne RNK u serumu omogućava dijagnostikovanje infekcije HCV još u ranom akutnom stanju, pre mogućnosti detektovanja specifičnih antitela, odnosno infekcije HCV kod imunokompromitovanih osoba koje ne razvijaju anti-HCV antitela. Takođe, utvrđivanje prisustva HCV RNK u serumu pacijenta rešava pitanja lažno pozitivnih rezultata EI testova ili intermedijernih rezultata RIBA testova. Testiranje prisustva HCV RNK pokazalo se korisno i za ustanovljavanje perinatalne transmisije virusa sa majke na novorođenče.

Zbog vrlo niskog titra virusnih čestica u serumu pacijenta, virusna RNK ne može biti detektovana direktno u serumu, već se prvo mora umnožiti PCR tehnikom.

 

Kvantitativni molekulski testovi

Ovi testovi se uglavnom koriste za praćenje rezultata terapije, s obzirom da su mnoge studije pokazale da uspešna terapija smanjuje nivo virusne RNK kod obolelih, odnosno da je nivo virusne RNK relativno stabilan kod osoba obolelih od hroničnog hepatitisa C koje nisu lečene.

 

 

Testiranje HCV u kliničkoj praksi

 

Za inicijalnu identifikaciju osoba inficiranih virusom hepatitis C koriste se testovi za skrining anti-HCV antitela u serumu. U slučaju EI testova druge i treće generacije, serumi pozitivni prilikom prvog testiranja se ponovo testiraju u duplikatu. Pozitivan uzorak, u nekim slučajevima, potrebno je dopunski testirati, serološkim ili molekulskim, potvrdnim testom. Kod osoba sa povećanim nivoom serumskih transaminaza i pripadnika rizičnih grupa, pozitivan rezultat EI testa je dovoljan za postavljanje dijagnoze. Međutim, kod populacija niskog rizika, dopunsko testiranje je neophodno. U tu svrhu se može koristiti EI test drugog proizvođača, ali najčešće se koriste RIBA testovi. Prisustvo antitela na HCV u serumu ne ukazuje na to da li se radi o aktuelnoj ili prošloj virusnoj infekciji, zato je potrebno utvrditi prisustvo HCV RNK molekula u serumu. Utvrđivanje prisustva HCV RNK u serumu pacijenta primenjuje se i u slučajevima:

 

  1. Anti-HCV slabo pozitivnih rezultata
  2. Anti-HCV pozitivnih pacijenata sa normalnim nivoom enzima jetre
  3. Anti-HCV negativnih pacijenata sa oboljenjem jetre koje podseća na virusni hepatitis
  4. Pacijenata sa akutnim hepatitisom C
  5. Monitoringa antivirusne terapije
  6. Predviđanja mogućnosti transmisije HCV infekcije sa majke na dete
  7. Utvrđivanja puteva transmisije

 

U slučaju pozitivnog testa za skrining anti-HCV antitela, negativan rezultat prilikom konfirmacionog testiranja RIBA testovima interpretira se kao odsustvo virusne infekcije, odnosno testirana osoba ne poseduje antitela na HCV, što ukazuje na lažnu pozitivnost testa za skrining anti-HCV antitela. Međutim, tokom prvih nedelja infekcije mogu se javiti lažno negativni rezultati jer se antitela još uvek ne mogu detektovati. Naime, HCV RNK se može detektovati najranije 7 – 15 dana nakon izlaganja virusu. Retki su slučajevi kada je serokonverzija odložena nekoliko meseci u odnosu na trenutak infekcije. Takođe, po završetku infekcije HCV antitela padaju ispod granice detektabilnosti, dok je u slučaju osoba sa hroničnom HCV infekcijom i imunokompromitovanih osoba, prisustvo HCV RNK jedini dokaz virusne infekcije. Neodređeni rezultati RIBA testova najčešće se sreću kod inficiranih osoba u procesu serokonverzije i nekih osoba sa hroničnom HCV infekcijom. Da bi se postavila dijagnoza potrebno je ponoviti test za skrining anti-HCV antitela nakon mesec dana ili pristupiti utvrđivanju prisustva HCV RNK u serumu.

 

Autor :

Prim.Dr.sci.med.Nada Vasiljević,specijalista-transfuziolog

I doktor AyurVeda medicine

 

Povezani članci

Ostavite odgovor

Vaša adresa e-pošte neće biti objavljena. Neophodna polja su označena *